Raja Phillip II meninggal tahun 336 SM oleh pembunuh gelap pada saat pernikahan putrinya. Alexander pun naik tahta menggantikan ayahnya pada usia 20 tahun. Sesaat setelah kematian Phillip, kota-kota di Yunani yang sebelumnya telah tunduk pada Makedonia seperti Athena dan Thebes memberontak. Alexander segera bertindak dan berhasil menggagalkan pemberontakan tersebut. Namun, tahun beikutnya terjadi pemberontakan kembali, dia memutuskan untuk bertindak tegas dengan mengahancurkan Thebes dan menjual seluruh penduduknya sebagai budak. Kejadian ini berhasil memadamkan keinginan kota-kota lain untuk memberontak.
Tahun 335 SM, Alexander menyerang Persia dengan membawa sekitar 42.000 pasukan. Selama dua tahun berikutnya Alexander memenangkan berbagai pertempuran melawan pasukan Persia hingga akhirnya dia berhasil mengalahkan pasukan yang dipimpin oleh Raja Persia Darius III pada 333 SM. Darius yang kabur berusaha untuk damai dengan menawarkan Alexander wilayah dan harta namun ditolak. Alexander mengatakan bahwa dia sekarang adalah Raja Asia dan hanya dia yang berhak menentukan pembagian wilayah. Alexander kemudian meneruskan ekspansi militernya hingga berhasil menaklukkan wilayah Mesir hingga ke perbatasan India sebelum terpaksa berhenti karena prajuritnya yang kelelahan karena pertempuran terus-menerus selama sepuluh tahun.
Alexander kemudian kembali ke kerajaanya untuk merencanakan ekspansi baru. Selama perjalanan ia mengeksekusi banyak satrap (semacam gubernur) dan pejabat yang bertindak melenceng sebagai contoh. Kemudian sebagai wujud terima kasih pada para prajuritnya, Alexander memberi sejumlah uang pada mereka dan menyatakan bahwa ia akan mengirim para veteran dan cacat kembali ke Makedonia. Namun tindakan ini justru diartikan sebaliknya oleh prajurit Alexander. Selain itu, mereka juga menentang sejumlah keputusan Alexander, seperti mengadopsi budaya Persia dan dimasukkanya pasukan dari Persia ke dalam barisan prajurit dari Makedonia. Sejumlah Prajurit kemudian memberontak di kota Opis. Alexander mengeksekusi para pemimpin pemberontakan tersebut, namun mengampuni para prajuritnya. Dalam upaya menciptakan perdamaian yang bertahan antara orang-orang Makedonia dan rakyat Persia, Alexander mengadakan pernikahan massal antara para perwiranya dengan wanita bangsawan dari Persia. Akan tetapi, hanya sedikit pernikahan yang bertahan lebih dari setahun.
Sewaktu di Babilonia, Alexander tiba-tiba terkena sakit parah dan mengalami demam selama 11 hari sebelumnya akhirnya meninggal pada tanggal 10 Juni 323 SM, dalam usia sekitar 33 tahun. Penyebab kematian yang sesungguhnya tidak jelas. Setelah kematian Alexander, tidak adanya ahli waris menyebabkan terjadi perpecahan dan pertempuran antara para bawahannya. Akhirnya, setelah perselisihan bertahun-bertahun, sekitar tahun 300 SM, kekuasaan atas bekas kerajaan Alexander terbagi menjadi 4 wilayah yang masing dikuasai salah satu jendral Alexander.
Walaupun hanya memerintah selama 13 tahun, semasa kepemimpinannya ia mampu membangun sebuah imperium yang lebih besar dari setiap imperium yang pernah ada sebelumnya. Pada saat ia meninggal, luas wilayah yang diperintah Alexander berukuran 50 kali lebih besar daripada yang diwariskan kepadanya serta mencakup tiga benua (Eropa, Afrika, dan Asia).
Penyatuan wilayah dari makedonia hingga persia oleh Alexander Agung menyebabkan terbetuknya perpaduaan kebudayaan Yunani, Mediterrrania, Mesir, dan Persia yang disebut dengan kebudayaan Hellenisme. Pengaruh Hellenisme ini bahkan sampai ke India dan Cina. Khusus di Cina, pengaruh kebudayaan ini dapat ditelusuri di antaranya dengan artefak yang ditemukan di Tunhuang.
Alexander selama ekspansinya juga mendirikan beberapa kota yang semuanya dinamai berdasarkan namanya, seperti Alexandria atau Alexandropolis. Salah satu dari kota bernama Alexandria yang berada di Mesir, kelak menjadi terkenal karena perpustakaannya yang lengkap dan bertahan hingga seribu tahun lamanya serta berkembang menjadi pusat pembelajaran terhebat di dunia pada masa itu. Gelar The Great atau Agung di belakang namanya diberikan karena kehebatannya sebagai seorang raja dan pemimpin perang lain serta keberhasilanya menaklukkan wilayah yang sangat luas hanya dalam waktu 10 tahun.